江湖论剑：具有免疫抑制能力的MSC为何败在治疗GVHD的3期临床试验？
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---致所有迷茫的小伙伴
干细胞成药之路崎岖漫长，2009年Prochymal治疗难治性GVHD3期临床试验失败，是MSC临床应用的一个灾难性事件，几乎否定了MSC的临床疗效。
2013年，一篇综述提出了失败的4个可能原因：即：MSC捐赠者的个体差异、表观遗传学重编程、免疫原性和冻存程序。
今天，东海先生提出了他的观点，即MSC的质量和治疗方案。
引言
导致造血干细胞移植（包括骨髓移植）失败的最主要原因是患者出现了移植物抗宿主病（GVHD）[1, 2]。3级急性GVHD患者的5年生存率为25%，而4级急性GVHD患者仅为5%[3]。
间充质干细胞（MSC）的出现，曾经给难治性GVHD带来了温暖的曙光，因为具有很强的免疫抑制能力，能抑制多种免疫细胞的激活，减少免疫排斥反应，而且MSC具有很低的免疫原性，即使异体使用也不引起免疫排斥反应（但也会被机体通过其他方式清除）。先是动物实验证明MSC能促进造血干细胞的植入和存活，而且还能减少GVHD的发生[4-7]；随后的临床研究进一步确认了MSC能有效治疗难治性GVHD[8-12]。
2009年Prochymal（骨髓MSC）治疗难治性GVHD的3期临床试验的失败，是MSC临床应用的一个灾难性事件，几乎否定了MSC的临床疗效[13]。4年后的2013年，一篇综述分析了Prochymal（骨髓MSC）3期临床试验失败的4个可能原因，即：MSC捐赠者的个体差异、表观遗传学重编程、免疫原性和冻存程序[14]。再4年后的2017年，由于不完全同意这篇综述的观点，本文章提出了Prochymal（骨髓MSC）治疗失败的2大重要因素，即MSC的质量和治疗方案。
MSC的质量
虽然2006年制定了大家比较认可的MSC鉴定标准（定义），但是这些鉴定标准并没有评价质量相关的指标；而且MSC具有多功能属性，很难有单一指标来界定MSC的质量。基于目前对间充质干细胞治疗机制的了解，间充质干细胞的功能评价标准主要在于2方面：分泌的细胞因子和免疫抑制能力[15-17]。分泌的细胞因子容易量化及检测，而免疫抑制能力不容易量化及检测。因为免疫抑制能力的检测涉及到免疫细胞的应答能力，不同个体的免疫细胞应答能力不同，甚至同一个体的不同状态下，免疫细胞的应答能力也不同；更关键的是，MSC的免疫抑制有多重机制，更难于统一量化。
年龄对MSC的一些功能和特性有重要的影响，尤其是分化和增殖能力随年龄增大而下降明显[18-22]，而且伴随着克隆形成单位的减少和衰老细胞的增多[22, 23]。甚至大龄个体来源的MSC失去了促进组织器官干祖细胞更新增殖的能力[23, 24]。
和正常人相比，造血干细胞移植后的患者，其骨髓中的MSC数量下降，主要原因可能是造血干细胞移植治疗前高剂量化疗药损伤骨髓MSC[25, 26]。接受高剂量化疗的恶性血液疾病患者，分离培养其骨髓MSC，发现其MSC的克隆形成能力和增殖能力明显不如正常人骨髓MSC，这提示患者自体骨髓MSC不适合自体治疗[25, 27]。
MSC的体外扩增培养，使得MSC不可避免地出现复制衰老，也就是说培养代数越高，DNA复制导致的细胞衰老会越多[28-31]。在高培养代数，MSC的胞体变大[22]，端粒长度缩短[32]，更容易引起瞬间血液介导的炎症反应（IBMIR）[33]和被补体所攻击损伤[33, 34]。有研究显示2-7代的MSC的免疫抑制能力没有明显差异，而7代后的MSC出现免疫抑制能力下降[35]。1-2代的Prochymal（骨髓MSC）治疗GVHD患者，其1年的生存率为75%，而3-4代Prochymal（骨髓MSC）的治疗组仅为21%[36]；这些数据表明Prochymal（骨髓MSC）在体外扩增时出现快速的细胞质量下降（3期病人多用量大，导致大量的高代数扩增），这也是Prochymal（骨髓MSC）3期临床试验失败的最大原因之一。
MSC治疗方案（剂量和频率）
当我们用MSC治疗疾病的时候，MSC的治疗方案是应该最先想到的事情。间充质干细胞具有归巢趋化特性，特异性地向损伤或低氧的组织趋化迁移，但间充质干细胞不能区分是急性炎症还是慢性炎症。如果机体内出现多系统多部位损伤，那么MSC都会向这些损伤部位趋化，导致了达到某个局部的细胞数偏少，因此，这种情况下应该增加MSC的使用量。比如，MSC静脉输入自身免疫性肝炎患者体内，MSC既要发挥免疫抑制的作用，还需要参与修复损伤的肝脏。MSC临床治疗GVHD常见剂量见下表。
尽管有不少临床研究使用单剂量MSC，但是有证据显示多次注射效果优于单次注射。MSC治疗心脏疾病1周后，存活的细胞低于1%[37, 38]，这意味着要维持良好的治疗效果，需要多次注射。动物实验也证明多次注射能有效地阻止GVHD的发生[39]。单次注射下，高剂量和低剂量的MSC治疗GVHD的疗效都没有明显的差异[40]。不少GVHD患者需要多次注射MSC才能取得很好的缓解效果[36, 41, 42]。同样的情况出现在肝衰竭的治疗中，单次注射MSC不能有效降低乙肝慢加急肝衰竭患者的死亡率[43]，但是多次注射MSC则可以[44, 45]。
既然Prochymal（骨髓MSC）的适应症是难治性GVHD（注意是难治性GVHD，而不是所有GVHD），那么反复多次Prochymal输入治疗已是必然。因此，没有多次（超过3次）治疗是Prochymal（骨髓MSC）3期临床试验失败的最大原因之二。当然，最佳治疗次数，需要通过大样本临床研究来确定。
其他影响因素
我们必须清醒地认识到，难治性疾病的治疗，都需要综合治疗，而不是单一使用MSC。比如MSC联合皮质类固醇激素治疗GVHD，能取得100%的缓解率[40]。因此，不要过高地期待单一MSC的治疗方法能有效治疗各种疑难性疾病。
静脉输入MSC后，大约70%的MSC会在肺脏滞留，然后被清除[46]。MSC治疗DSS诱导的肠炎小鼠模型，腹腔注射的疗效优于尾静脉注射[47]。另有研究显示用胎牛或小牛血清培养MSC，可以增加MSC的免疫原性，从而加快机体清除MSC的速率[48, 49]。
小结
虽然MSC的临床研究风风火火开展了一二十年，却无法取得可信服的治疗结果。由于某种未知的想法所影响，绝大部分MSC的临床研究采取单次输入治疗，然后期待这一次的输入治疗，MSC能发挥神仙水的作用，一劳永逸地解决各自疑难疾病。观察到一次MSC输入治疗效果不佳，又开始各自怀疑MSC不能治疗疾病。难道这些MSC的临床研究工作者没有想起药理学的一个重要概念：有效的血药浓度？
以一个小例子来结束本文：米饭能填饱肚子，但是一粒米饭能填饱肚子吗？
参考文献（略）
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本文作者东海先生，首发于《间充质干细胞》。本文经东海先生授权发布。
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